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如何让外泌体机制研究“简而不失其华”？

如何让外泌体机制研究“简而不失其华”？

分类：华盈视角
作者：瑞瑞
来源：k8凯发(中国)公众号

【概要描述】外泌体机制研究中如何应用组学技术及多组学联合分析？

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如何让外泌体机制研究“简而不失其华”？

【概要描述】外泌体机制研究中如何应用组学技术及多组学联合分析？

分类：华盈视角
作者：瑞瑞
来源：k8凯发(中国)公众号
发布时间：2021-12-29 15:24
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外泌体的机制研究涉及到多个层次和多方面科学问题的探究。起于外泌体的生物学作用的证实，进而分析外泌体如何发挥作用，前者主要是表型的分析，后者包括了外泌体影响的分子层面的变化及外泌体中执行功能的关键元素是什么。组学技术的介入已然为我们研究外泌体怎样发挥作用提供了一种事半功倍的策略。

那么外泌体机制研究中如何应用组学技术及多组学联合分析？其分析是否非常复杂？华盈视角就为大家分享几篇外泌体机制研究中组学及多组学联合应用的案例，或许能为大家的研究提供新的思路。

| 案例一:多组学联合分析心肌球细胞来源的外泌体处理心律失常性心肌炎的作用机制

心律失常性心肌炎（ACM）是一种遗传性心脏疾�。芯咳嗽蓖ü嘧檠Я戏治隽�永生化心肌球细胞来源的外泌体在ACM模型Dsg2突变小鼠中的作用及机制，相关成果近期发表于心脏领域的顶级期刊European Heart Journal（IF: 29.983）¹。研究人员在突变鼠4周龄时开始尾静脉注射外泌体，发现了心肌球细胞来源的外泌体可以改善突变鼠心室功能及结构、减少纤维化和心律失常等（图1）。

图1：收集心肌球细胞来源的外泌体和处理突变小鼠

因为炎症相关信号在ACM的进展中起到非常重要的作用，研究人员首先通过转录组学分析了外泌体处理的突变鼠、对照处理的突变鼠和野生型小鼠心脏组织的基因表达，结果发现了外泌体可以“纠正”突变鼠心脏中很多炎症基因的异常表达（图2A）。炎症因子转录水平发生变化，那么蛋白水平是否也发生了变化？于是研究人员采用了抗体芯片的方法检测上述三组小鼠心脏的相关细胞因子的变化。结果发现了和野生型小鼠相比，突变鼠中多种细胞因子的表达显著增加，但是外泌体处理会显著降低突变鼠中这些细胞因子的表达（图2B），说明外泌体处理可以缓解ACM中的炎症反应。

图2：外泌体改变突变鼠心脏组织的基因和细胞因子表达

转录组和细胞因子抗体芯片的结果都发现了NF-κB通路的分子在突变鼠中显著上调，这些结果与NF-κB可以促进炎症反应和心肌细胞死亡的重要作用相一致。研究人员继而验证了外泌体的确可以减弱NF-κB信号通路的活性（图3A）。那么外泌体调控心肌细胞NF-κB信号通路的机制和功能分子是什么？因为研究的是永生化细胞，所以原代心肌球细胞用作对照，研究人员对两种心肌球细胞来源的外泌体开展了small-RNA测序，总共鉴定了850多个miRNA。其中表达丰度最高的前21个miRNA通过Ingenuity Pathway Analysis （IPA）分析发现了很多都与NF-κB通路相关（图3B），其中有6个miRNA在永生化心肌球细胞来源的外泌体中显著上调，于是研究人员用外泌体处理敲降了6个miRNA表达的新生大鼠心室肌细胞，结果发现只有缺失miR-4488可以导致外泌体对NF-kB通路的减弱效果消失（图3C），说明外泌体通过其含有的miR-4488发挥作用，最后体内实验也证明了同时在突变鼠中注射外泌体和干扰miR-4488 RNA后，外泌体失去了治疗作用（图3D）。

图3：外泌体治疗ACM的作用机制

研究人员也对外泌体进行了蛋白质组学的分析，鉴定了很多在永生化心肌球细胞来源的外泌体中高表达及特有的蛋白（图4）。GO分析发现这些蛋白与细胞生长、能量代谢和信号转导相关，推测外泌体传递这些蛋白到心肌细胞可以便于心肌修复，也为后续鉴定外泌体中关键蛋白分子奠定了前期基础。

图4：外泌体蛋白质组学分析

| 案例二:蛋白质组学应用于烟雾病相关的外泌体研究中

烟雾病是一种病因不明、大脑血管慢性进行性狭窄或闭塞为特征，并继发颅底异常血管网形成的脑血管疾病。近期来自解放军总医院第五医学中心和北京协和医学院的研究人员对烟雾病病人血清外泌体开展了功能研究，相关成果发表于该领域权威期刊Stroke（IF: 7.914）²。研究者纳入了132个烟雾病病人包括77个缺血性病人（ischemic）和55个出血性病人（hemorrhagic），以及22个健康对照。研究人员对血清来源的外泌体开展了TMT蛋白质组学分析和细胞功能实验（图5）。

图5：烟雾病血清外泌体功能实验及蛋白质学分析

qEV或者TEI试剂盒收集的血清外泌体开展细胞功能实验，结果发现烟雾病人血清来源的外泌体可以显著促进小鼠脑血管内皮细胞的增殖，出血性烟雾病人血清外泌体（Hemo）的作用效果最显著。为了解释外泌体对脑血管内皮细胞的作用机制，研究者对外泌体处理的细胞开展了TMT蛋白质组学分析。细胞的TMT蛋白质组总共鉴定了6516个蛋白（unique peptides≥2），相比其他两组，在出血性血清外泌体处理的细胞中鉴定了17个下调的蛋白（Cluster 1）和32个上调的蛋白（Cluster 2）（图6A）。GO和WikiPathway富集分析发现了这些差异蛋白大多属于线粒体及相关的成分（图6B、C）。由此可推测出血性烟雾病人血清来源的外泌体主要通过影响脑血管内皮细胞的线粒体功能絮乱发挥作用，为后续再开展深入的机制研究锁定了潜在的作用靶点。

图6：TMT蛋白质组学分析外泌体处理的脑血管内皮细胞

烟雾病病人血清外泌体上述作用的功能分子是什么？研究人员对超离收集的正常、缺血性和出血性烟雾病人血清外泌体进行了两组重复的TMT蛋白组实验（图5），两组分别鉴定了890个和1128个血清外泌体蛋白（unique peptides≥2），其中两组实验共同鉴定到了859个外泌体蛋白。与正常血清外泌体对比，缺血和出血烟雾病人血清外泌体共有231个差异蛋白。GO分析这些上述差异蛋白发现了24.8%（57个）的蛋白与细胞生长及维持有关，彼此间可以形成紧密的互作网络（图7），由此可推测烟雾病人血清外泌体调控脑血管内皮细胞增殖等效果或许通过传递这些通路蛋白发挥其作用。

图7：外泌体蛋白质组学分析

| 案例三:多组学分析真菌感染的巨噬细胞来源的外泌体的功能成分

新生隐球菌（Cryptoccus neoformans）在免疫力低下的人群中会引起肺和脑亚急性或慢性感染。来自上海长征医院联合国内外多家科研机构的研究人员通过多组学联合分析了新生隐球菌感染的巨噬细胞释放的外泌体的功能组分，相关成果近期发表于该领域的权威期刊mBio（IF: 7.867）³。研究人员首先收集了正常小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）、灭活菌感染的BMDM细胞以及活菌感染的BMDM细胞分泌的外泌体，对比分析正常BMDM细胞在被上述三类外泌体处理后的抗真菌活性，结果发现了在活菌感染来源的外泌体处理之后具有更显著的抗真菌能力（图8 A）。为了揭示正常巨噬细胞在受到外泌体处理后分子层面的改变，研究人员通过转录组学分析了外泌体处理和不处理的小鼠BMDM细胞及人外周血来源的巨噬细胞（MDM）的差异基因表达（图8 B），GO分析发现了两类细胞的差异基因很多都和细胞周期和分裂相关，说明了真菌感染的巨噬细胞来源的外泌体可能通过影响正常巨噬细胞的细胞周期相关通路发挥作用。

图8：转录组分析外泌体处理的巨噬细胞

为了对比上述不同处理BMDM细胞来源的外泌体中成分差异性，研究人员对上述三种来源的外泌体开展了蛋白质组学、脂质组学和代谢组学的分析，总共鉴定了1481个蛋白，226个脂类和59个代谢产物。蛋白质组学分析鉴定了三组之间有46个差异蛋白（图9 A）。脂质组学分析发现了最显著差异的脂类包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和鞘磷脂（SM）（图9 B）。代谢组学分析却发现各组之间外泌体中并没有显著差异的代谢物，这些结果表明了新生隐球菌感染的巨噬细胞来源的外泌体发挥其作用可能主要依赖于外泌体载有的蛋白或者脂质的分子功能。

图9：外泌体蛋白质组和脂质组学分析

从上述的研究案例我们可以看到，外泌体机制研究中的组学分析并不复杂，反而让我们的机制研究变得简约但不简单。组学技术主要涉及到其中两处关键科学问题的解决，第一个是外泌体对受体组织/细胞分子层面的影响，这是解释疾病现象最重要的潜在机制，例如这些案例采用了转录组学、蛋白质组学及抗体芯片等高通量的筛选方法去锁定某些通路或者差异蛋白的功能变化；第二个是探究外泌体中哪些元素起到重要作用，这是提升外泌体机制研究深度和档次的关键环节，多种组学都可以尝试被用来筛选外泌体的功能分子。最重要的是外泌体组学和受体细胞组学间可以彼此呼应，例如第一个案例中心脏组织细胞因子筛选和外泌体中miRNA组学进行了联合分析，发现了外泌体中靶向NF-κB通路的关键功能分子miR-4488，研究深度随即加深，理所当然可以发到更高分的期刊。组学分析也可以起到承前启后的作用，例如后两个案例通过组学分析发现了受体细胞和外泌体中很多关键的通路和蛋白，为之后再继续深入研究提供了宝贵数据。

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| 相关文献

[1]. Lin YN, Mesquita T, Sanchez L, Chen YH, Liu W, Li C et al. Extracellular vesicles from immortalized cardiosphere-derived cells attenuate arrhythmogenic cardiomyopathy in desmoglein-2 mutant mice. [J]. Eur Heart J. 2021:ehab419.

[2]. Wang X, Han C, Jia Y, Wang J, Ge W, Duan L. Proteomic Profiling of Exosomes From Hemorrhagic Moyamoya Disease and Dysfunction of Mitochondria in Endothelial Cells. [J]. Stroke. 2021:STROKEAHA120032297.

[3]. Zhang L, Zhang K, Li H, Coelho C, de Souza Gonçalves D, Fu MS et al. Cryptococcus neoformans-Infected Macrophages Release Proinflammatory Extracellular Vesicles: Insight into Their Components by Multi-omics. [J]. mBio. 2021;12(2):e00279-21.

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